本发明涉及同时识别吡虫啉和甲基对硫磷农药的双特异性单克隆抗体及其制备方法，属于生物技术领域。用杂交-杂交瘤技术将分泌抗甲基对硫磷单克隆抗体的杂交瘤细胞和经吡虫啉抗原免疫的小鼠脾细胞进行融合，获得了能稳定分泌同时抗甲基对硫磷和吡虫啉农药的双特异性单克隆抗体FQ-D6。此抗体经过有效性验证证明可用于农业生产环境和农产品中甲基对硫磷和吡虫啉残留的快速灵敏检测。本发明涉及的同时抗甲基对硫磷及吡虫啉农药双特异性单克隆抗体制备技术简便可行，抗体的整个制备过程无需特别的仪器设备，容易工厂化规模生产。
1.一种同时检测吡虫啉和甲基对硫磷的双特异单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCxa0NO：C201274的三体杂交瘤细胞株FQ-D6产生，为IgG2b-IgG1型，抗体轻链为kappa链。xa0
2.产生权利要求1所述的同时检测吡虫啉和甲基对硫磷的双特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株FQ-D6，于2012年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCxa0NO：C201274。xa0(一)技术领域本发明涉及应用于同时检测吡虫啉和甲基对硫磷双特异性单克隆抗体及制备方法，属于生物技术领域。专用于农产品和农业生产环境中吡虫啉、甲基对硫磷残留的灵敏、快速检测，特别适用于大批量样品检测。(二)背景技术吡虫啉(imidacloprid，1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺)和甲基对硫磷(Parathion-methyl，O，O-二甲基-O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯)是农业生产中被广泛使用的杀虫剂，吡虫啉属于中等毒性新型烟碱类杀虫剂，而甲基对硫磷属于高毒有机磷酸酯类杀虫剂。目前，对这两种农药在农产品中的残留检测采用的是气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)；对这两种农药残留免疫分析方法也有相关报道，但同时针对这两种农药的免疫多残留检测方法却仍未见报道。农药多残留免疫分析技术主要有以下三种：1.将多种半抗原偶联到一个载体蛋白上，免疫动物获得抗血清进行农药多残留分析；2.提取一系列农药的公共结构，设计出通用半抗原，免疫动物获得单克隆抗体用于农药多残留分析；3.双特异性抗体法。第一种方法因只能够得到多克隆抗体而使其在生产上受到一定局限；第二种方法所制备的单克隆抗体只能够识别一类农药，对于不同种类的农药并不能同时检测；而双特异性抗体很好地解决了这个问题，双特异性抗体因其具有两个不同的抗原结合位点，而达到同时检测不同种类农药的目的。制备双特异性抗体主要有以下三种方法：化学交联法、杂交-杂交瘤技术和基因工程抗体技术。本发明利用甲基对硫磷杂交瘤细胞与受吡虫啉免疫原免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合的技术，制备出分泌同时抗吡虫啉-甲基对硫磷单克隆抗体的三体杂交瘤细胞。(三)发明内容技术问题本发明的目的是提供一种可用于同时检测甲基对硫磷和吡虫啉农药残留的双特异性单克隆抗体及其制备方法。通过将分泌抗甲基对硫磷单克隆抗体的杂交瘤细胞与受吡虫啉免疫原免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合的策略来制备能分泌抗甲基对硫磷-吡虫啉双特异抗体的三体杂交瘤细胞。技术方案1.抗甲基对硫磷和吡虫啉双特异性单克隆抗体，是由三体杂交瘤细胞株FQ-D6产生的，为IgG2b-IgG1型，抗体轻链为kappa链。2.抗甲基对硫磷和吡虫啉双特异性单克隆抗体的制备方法，包括：(1)分泌抗甲基对硫磷单克隆抗体的HGPRT酶缺陷型杂交瘤细胞株筛选将分泌抗甲基对硫磷抗体的杂交瘤细胞株置于5ug/ml8-AG培养基中培养，在培养过程中逐渐提高培养基中8-AG浓度，最终使细胞株能适应在50ug/ml的8-AG的培养基中生长；之后利用HAT选择性DMEM培养基进行筛选，通过细胞是否存活来鉴别细胞中的酶是否缺失，缺失条件下进行克隆并扩大培养，并将细胞冻存备用。(2)受吡虫啉免疫原免疫BALB/C小鼠脾细胞的准备将受吡虫啉免疫原5免，血清效价达到1∶32000以上的BALB/C小鼠加强免疫3天后，眼眶取血并制备血清，作为三体杂交瘤细胞筛选时的阳性对照；将放血后的小鼠拉颈脱臼处死，并处于75％酒精体表消毒10分钟，随后移入超净工作台内，放置于无菌培养皿内，左侧腹部朝上；利用无菌手术镊和眼科剪取出小鼠脾脏，用DMEM基础培养基轻轻洗涤，尽可能剥去脾脏周围的脂肪和结缔组织；将脾脏置于120目的尼龙滤袋内，并放入另一个盛有DMEM基础培养液的培养皿中；将尼龙滤袋中的脾脏扎破并不断挤压，使脾细胞完全释放到DMEM基础培养液中；将脾细胞悬液转移到50ml离心管中，1000rpm离心10分子，弃上清，将沉淀用约30mlDMEM培养液再洗一次后悬浮，备用(3)细胞融合将脾细胞与生长状态良好的分泌抗甲基对硫磷抗体的HGPRT酶缺陷型杂交瘤细胞株通过杂交-杂交瘤技术制备三体杂交瘤细胞。并于37℃，体积比5％二氧化碳培养箱培养，待7天后通过非竞争ELISA检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞。(4)三体杂交瘤细胞的筛选对融合孔细胞上清采用间接非竞争ELISA法进行初步筛选，方法为：用碳酸盐包被缓冲液分别稀释甲基对硫磷及吡虫啉包被原，96孔酶标板中每孔加入50ul，于4℃下孵育过夜，将酶标板中包被液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；将明胶用超纯水配置成1％的封闭液，96孔酶标板中每孔加入200ul，37℃孵育1.5小时，将酶标板中封闭液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次96孔酶标板中每孔加入50ul收集到的待测融合孔细胞上清；将受免疫小鼠血清用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释，96孔酶标板中每孔加入50ul作为阳性对照；96孔酶标板中每孔加入50ul未融合细胞上清作为阴性对照。37℃孵育1小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体，96孔酶标板中每孔加入50ul，37℃下孵育45分钟，将酶标板中反应液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用柠檬酸钠底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50ul，37℃黑暗条件下反应10分钟；96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25ul，终止显色；终止显色后的酶标板立即在450nm下测定各孔单波长吸光值；两种包被原下，有融合细胞的上清液读数均等于或大于阴性对照读数的2.1倍时，这样的融合孔即为阳性孔；为了进一步确定筛选到阳性孔所分泌抗体是同时识别甲基对硫磷和吡虫啉的双特异性单克隆抗体，再通过间接竞争ELISA法筛选，方法为：用碳酸盐包被缓冲液分别稀释甲基对硫磷、吡虫啉包被原，96孔酶标板中每孔加入50ul，于4℃下孵育过夜，将酶标板中包被液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；将明胶用超纯水配置成1％的封闭液，96孔酶标板中每孔加入200ul，37℃孵育1.5小时，将酶标板中封闭液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；分别配置一系列浓度的甲基对硫磷和吡虫啉农药标准品甲醇溶液，用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释20倍后，与细胞培养上清液等体积充分混合；将两种农药-细胞上清混合液以每孔50ul加入酶标板中；以为融合细胞上清与含0.05％吐温20磷酸盐缓冲液等体积混合液作为阴性对照；37℃孵育1小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体，96孔酶标板中每孔加入50ul，37℃下孵育45分钟，将酶标板中反应液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用柠檬酸钠底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50ul，37℃黑暗条件下反应10分钟；96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25ul，终止显色；终止显色后酶标板立即在450nm下测定各孔单波长吸光值。设定甲基对硫磷包被原包被下，不含农药的细胞上清的读数为B₀₁，含有甲基对硫磷农药的细胞上清读数为B₁₁，含有吡虫啉农药的细胞上清液读数为B₁₂；吡虫啉包被原包被下，不含农药的细胞上清的读数为B₀₂，含有甲基对硫磷农药的细胞上清读数为B₂₁，含有吡虫啉农药的细胞上清液读数为B₂₂。当同时出现以下现象时：B₁₁＜B₀₁，B₁₂＝B₀₁，B₂₁＜B₀₂，B₂₂＝B₀₂，便可以认定其分泌的抗体为双特异性单克隆抗体，并利用有限稀释法对细胞进行亚克隆，其分泌的上清即为所制的双特异性单克隆抗体。产生上述双特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株分类命名为：杂交瘤细胞株FQ-D6；2012年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为：CCTCCxa0NO：C201274有益效果实用性好：传统的农药分析主要在实验室进行，其前处理过程烦琐，分析速度慢、成本高，同时使用的大量有机溶剂易造成环境污染，且对实验室的仪器化程度和人员专业素质要求较高，不能满足农产品贸易中对快速、简便、准确、大量检测的要求。而我们提供的以抗原抗体反应为基础的ELISA(酶联免疫吸附分析)方法具有操作简便、快速、分析成本低、安全可靠等优点，一般不需要贵重仪器，可大量简化样品前处理过程，对使用人员的专业技术要求不高，容易普及和推广，特别适用于大批量样本检测和现场检测。检测范围广：利用杂交-杂交瘤技术制备的双特异性单克隆抗体，具有同时检测两类农药结构的特性，相比常规单克隆抗体而言，检测范围更宽，应用前景更好。抗体稳定性好：此法所获得的杂交瘤细胞在液氮条件下至少可以保存3年，所纯化的抗体在-20℃条件下可存放2年
附图说明
(1)吡虫啉、甲基对硫磷的标准工作曲线
具体实施方式
实施例1自来水样品中吡虫啉、甲基对硫磷残留量检测ELISA反应体系主要条件吡虫啉包被原浓度为4.88ug/ml，腹水稀释倍数为2000倍；甲基对硫磷包被原浓度为2.3ug/ml，腹水稀释倍数为4000倍。1％明胶作封闭液，抗原抗体反应液(含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液)中甲醇含量为5％、pH值为8.5、离子强度为0.8mol/L，微量分析板中每孔50ul。待测样品准备自来水样品：将吡虫啉和甲基对硫磷农药配成不同浓度的甲醇溶液，吡虫啉浓度分别为6，12ug/ml，甲基对硫磷浓度分别为0.64，1.28ug/ml。将以上农药甲醇溶液用自来水稀释20倍后，农药浓度分别为：吡虫啉300，600ng/ml，甲基对硫磷32，64ng/ml。采用ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下：(1)包被吡虫啉包被原浓度为4.88ug/ml，甲基对硫磷包被原浓度为2.3ug/ml，在96孔酶标板中每孔加入50ul，4℃孵育过夜，倒尽，(2)封闭1％明胶作封闭物，96孔酶标板中每孔加入200ul，37℃孵育1.5小时，倒尽，以含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次，并拍干；(3)加样将上述准备的吡虫啉、甲基对硫磷溶液与保藏编号为CCTCCxa0NO：C201274三体杂交瘤细胞所分泌的抗体溶液等体积混合后加入酶标板中，96孔酶标板中每孔加入50ul，37℃孵育1小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；(4)加酶标二抗用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体，96孔酶标板中每孔加入50ul，37℃下孵育45分钟，将酶标板中反应液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；(5)数据处理将所获得的结合率(B/B₀)代入图1中吡虫啉、甲基对硫磷的标准曲线中，获得吡虫啉和甲基对硫磷的浓度，将所获得的浓度数据乘以倍数2。并与添加浓度相比，获得吡虫啉在自来水中的添加回收率为97％-104％，甲基对硫磷的添加回收率为87％-99％。实施例2池塘水样品中吡虫啉、甲基对硫磷残留量检测ELISA反应体系主要条件同实施例1待测样品准备池塘水样品：将收集到的池塘水离心，取上清液进行实验。吡虫啉和甲基对硫磷农药配成不同浓度的甲醇溶液，吡虫啉浓度分别为6，12ug/ml，甲基对硫磷浓度分别为0.64，1.28ug/ml。将以上农药甲醇溶液用池塘水稀释20倍后，农药浓度分别为：吡虫啉300，600ng/ml，甲基对硫磷32，64ng/ml。采用ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下：步骤(1)、(2)同实施例1(3)加样将上述准备的吡虫啉、甲基对硫磷溶液与抗体溶液等体积混合后加入酶标板中，96孔酶标板中每孔加入50ul，37℃孵育1小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；(4)加酶标二抗用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体，96孔酶标板中每孔加入50ul，37℃下孵育45分钟，将酶标板中反应液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；(5)数据处理将所获得的结合率(B/B₀)代入图1中吡虫啉、甲基对硫磷的标准曲线中，获得吡虫啉和甲基对硫磷的浓度，并将所获得的浓度数值乘以倍数2。并与添加浓度相比，获得吡虫啉在池塘水中的添加回收率为102％-104％，甲基对硫磷的添加回收率为102％-104％。